作者：赵世浩 张雪 柯越海
细胞衰老是驱动衰老相关疾病的关键因素。衰老相关分泌表型、端粒损伤、表观遗传学改变、线粒体自噬受损等介导了细胞衰老相关特发性肺纤维化的发病；降低细胞衰老水平或清除衰老细胞可下调纤维化因子表达，缓解特发性肺纤维化进程。本文就近年来细胞衰老在特发性肺纤维化中的作用及机制研究进展作一综述。
特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一种病因不明的慢性纤维化肺病，病理特征为弥漫性肺泡结构损伤导致的进行性、不可逆肺间质纤维化重构，患者中位生存期仅为2~3年。IPF的致病机制尚不清楚。最初认为炎症是IPF的主要驱动因素，但大量证据表明炎症并非IPF发生、发展所必需，且临床检测发现炎症与IPF的发展阶段和后果无关。临床上抗炎药物泼尼松和N-乙酰半胱氨酸联用对IPF病情无明显改善，反而增加了患者住院率和病死率。流行病学研究数据显示，美国约2/3的IPF患者确诊时年龄大于60岁，确诊时的平均年龄为66岁。与健康人群比较，IPF患者肺组织衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)、p21阳性上皮细胞增加，成纤维细胞表现出复制性衰老。2011年，Baker等首先指出，细胞衰老是多种年龄相关病理进程的直接驱动因素。目前关于细胞衰老与IPF的研究多集中于肺上皮细胞和成纤维细胞。本文就这方面研究进展作一综述。
1. 细胞衰老的特征及其信号通路
1961年，Hayflick等首次引入“细胞衰老”这个概念来描述正常人成纤维细胞连续传代后增殖能力受限的现象。细胞衰老是指细胞增殖处于不可逆抑制状态，细胞周期通常永久性停滞在G0或G1期，形态上表现为细胞扁平化、细胞核增大、染色质聚集等。衰老细胞的另一个重要特征就是分泌多种细胞因子、趋化因子、生长因子和基质金属蛋白酶等，组成衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)。研究表明，SASP广泛参与细胞增殖、迁移、炎症、纤维化等进程。端粒缩短、DNA损伤、氧化应激、抗肿瘤药物等多种应激均可诱导细胞衰老进程。其中，由端粒缩短引起的细胞衰老称为复制性衰老，而由氧化应激、DNA损伤、原癌基因激活等外源性压力诱导的细胞衰老称为早衰。SA-β-Gal特异性表达于衰老细胞，是鉴定细胞衰老的主要标志物。此外，p16、p21等细胞周期抑制蛋白在衰老细胞中的表达上调；而细胞周期蛋白A(cyclin A)、细胞周期蛋白B(cyclin B)等促细胞周期蛋白的表达则受到抑制。
诱发细胞衰老的信号通路主要有两条：p16-Rb和p53-p21。p16可竞争性结合CDK4/6，抑制其激酶活性，进而减弱Rb磷酸化，未磷酸化的Rb无法激活下游转录因子E2F1，从而阻断细胞周期由G1期向S期转化。p53是在衰老细胞中高度表达的肿瘤抑制因子，一般处于失活状态。当细胞应激导致DNA损伤或Ras激活时，p53活化，导致p21上调，抑制Rb磷酸化，细胞生长停滞，最终停留在G1期。此外，还存在非依赖p16/p53的细胞衰老途径，即SKP2-p27-CDK信号通路。SKP2失活导致p27不能被磷酸化，使其无法降解，继而抑制细胞进入S期，引发细胞衰老。
2. 上皮细胞衰老与特发性肺纤维化
肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells, AEC)分为Ⅰ型和Ⅱ型。其中，Ⅰ型AEC是构成AEC屏障的重要成分，参与气体交换；Ⅱ型AEC可分泌肺泡表面活性物质，维持肺泡微环境稳态。此外，Ⅱ型AEC还具有干细胞能力，可分化为Ⅰ型AEC修复受损的AEC屏障。当Ⅱ型AEC衰老时，细胞周期阻滞，无法维持AEC屏障，导致成纤维细胞激活、增殖、胶原沉积，从而形成纤维化瘢痕。Lehmann等报道，在IPF患者离体肺组织的AEC中，p16、p21表达增加, 且p16水平与肺一氧化碳扩散能力呈现负相关，提示AEC衰老水平与IPF严重程度正相关。最近研究显示，SASP、端粒损伤、表观遗传学改变、线粒体自噬受损等介导了细胞衰老相关的IPF发展。
2.1. SASP
在健康组织中，衰老细胞通常是通过抑制自身增殖，分泌SASP因子，创造炎症微环境，招募吞噬细胞，清除受损细胞，促进组织再生。然而，在病理状态或衰老组织中，这种修复过程出现异常，衰老细胞持续积累，破坏正常组织微环境，导致异常的组织重塑。Minagawa等研究表明，TGF-β可以诱导上皮细胞衰老，分泌过量的IL-1β，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，而过表达去乙酰化酶6(SIRT6), 通过蛋白酶体降解p21，可有效抑制TGF-β诱导的上皮细胞衰老。Schafer等发现，辐照诱导的衰老成纤维细胞分泌的SASP蛋白水平呈3~200倍增加，包括IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、MCP-1、PAI-1和MMP-12等，这些因子又促进了正常成纤维细胞激活。Aoshiba等研究显示，在博来霉素诱导的纤维化小鼠肺中p21表达增加，IL-6、TNF-α、TGF-β、MMP-2等SASP因子上调。Shivshankar等报道，敲除小窝蛋白-1(caveolin-1)可降低博来霉素引发的小鼠AEC衰老和凋亡, 血管周围和肺泡区域的SASP分子MMP-2、MMP-9下降，肺纤维化症状缓解。最近研究指出，衰老细胞的细胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)是一种新的SASP因子，可以参与信号传导，精准调控受体细胞衰老、炎症、癌症等发展过程。Fujita等研究发现，香烟烟雾提取物能够诱导人支气管上皮细胞分泌含miR-210的细胞外囊泡，通过负向调控自噬相关蛋白ATG7，抑制自噬，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，引发气道纤维化。降低细胞衰老水平或清除衰老细胞能够有效缓解肺纤维化症状。Pan等研究指出，通过饲喂衰老细胞清除药物(senolytics)ABT-263，可选择性杀死小鼠肺组织中衰老的Ⅱ型AEC，逆转辐照诱导的肺纤维化。Schafer等发现，达沙替尼与槲皮素联用可清除博来霉素诱导的小鼠p16阳性衰老细胞，MCP-1、IL-6、TGF-β等SASP因子水平下降，有效改善小鼠肺功能。在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中，静脉注射人类脂肪来源的间充质干细胞能够下调IL-2、IL-1β、TNF等炎症因子和碱性成纤维细胞生长因子、结缔组织生长因子、Ⅲ型胶原α1等促纤维化分子的表达，相较于吡非尼酮，显著改善肺结构，提高小鼠存活率，治疗早期肺损伤效果更佳。最近一项临床1b期研究指出，中重度IPF患者静脉注射非血缘捐赠者胎盘来源干细胞具有良好的短期安全性，为进一步的功效研究奠定了基础。
2.2. 端粒损伤
端粒位于染色体末端，可以保护染色体末端免受损伤，并在每次细胞分裂后缩短，一旦到达临界长度，DNA损伤反应(DNA damage response)就会被激活，由此引发细胞衰老和凋亡。63例IPF患者肺组织中检测端粒长度发现，纤维化区域的Ⅱ型AEC端粒长度短于周围细胞，Ⅱ型AEC的端粒长度与IPF患者的存活率呈正相关。在小鼠Ⅱ型AEC中选择性敲除端粒结合因子1(telomere repeat binding factor 1)，9个月后端粒缩短，p53和p21上调，SA-β-Gal阳性Ⅱ型AEC大量累积，诱发年龄依赖的肺重构和纤维化。Alder等研究报道，Ⅱ型AEC特异性敲除端粒结合因子2小鼠，在Ⅱ型AEC细胞中存在端粒功能障碍，激活DNA损伤反应，导致p53和p21表达增加，从而限制Ⅱ型AEC细胞的自我更新和分化能力，表现出对博来霉素诱导肺损伤的修复能力下降。Townsley等研究显示，27例端粒损伤患者(大部分伴有肺纤维化)口服雄激素特性合成药物达那唑两年后，外周血白细胞端粒长度增加，基于CT25的肺纤维化评分稳定，展现出良好的应用前景。
2.3. 线粒体自噬受损
Wiley等发现，线粒体功能障碍是驱动细胞衰老的重要途径。线粒体自噬可以选择性降解功能损伤的线粒体，维持干细胞处于静止状态，抵抗细胞衰老。研究表明，衰老细胞线粒体自噬水平下降，而重建自噬可逆转细胞衰老并恢复老年肌肉干细胞的再生功能。Araya等证实，IPF患者肺组织中自噬缺乏，导致支气管上皮细胞衰老，诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。PTEN-诱导假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1, PINK1)在促进线粒体自噬、清除功能异常线粒体的过程中发挥重要作用。小鼠肺组织Ⅱ型AEC中敲除PINK1可导致线粒体肿胀和功能失调，从而产生线粒体自噬受损，致使小鼠更易罹患肺纤维化。
2.4. 表观遗传学改变
Disayabutr等研究发现，衰老相关的miR-34家族成员miR-34a、miR-34b、miR-34c在IPF患者Ⅱ型AEC细胞中高表达，并且在A549细胞过表达miR-34a、miR-34b、miR-34c后，可见p16、p21 mRNA表达上调，SA-β-Gal活性增加。Cui等研究显示，Ⅱ型AEC条件性敲除miR-34a可有效改善博来霉素诱导的上皮细胞衰老及肺纤维化症状。
3. 成纤维细胞衰老与特发性肺纤维化
病理状态下，成纤维细胞在气体交换区域可产生细胞外基质，是造成纤维化破坏过程的关键效应细胞。Yanai等发现，从IPF患者肺组织中分离出的成纤维细胞呈现加速的复制性衰老，细胞形态发生不规则改变。IPF患者纤维化病灶成纤维细胞中Fas表达缺乏，表明其具有凋亡抗性。成纤维细胞衰老被认为是减弱纤维化的一种自我限制。Li等研究结果显示，在成纤维细胞中特异性敲除透明质酸合成酶2(hyaluronan synthase 2, HAS2)，内质网应激蛋白Perk、elF2α磷酸化上调，SA-β-Gal阳性细胞群体增加，能极大缓解博来霉素诱导的肺纤维化。有趣的是，敲除HAS2后，经典的细胞衰老相关蛋白p53、p21、p16表达并无改变，而p27表达明显上调，SKP2表达下降，表明HAS2敲除诱导的成纤维细胞衰老依赖于SKP2-p27-CDK2途径。Romero等研究结果表明，衰老成纤维细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mTORC1)活化增加，自噬水平下降，从而导致成纤维细胞获得凋亡抗性。Hecker等通过敲除Nox4恢复博来霉素损伤引发的衰老小鼠氧化还原失衡，降低肌成纤维细胞的凋亡抵抗，逆转了持续性肺纤维化。目前成纤维细胞衰老在IPF进程中的作用机制尚未明确，仍需进一步探索。
4. 结语
综上所述，SASP、端粒损伤、表观遗传学改变、线粒体自噬受损等介导了细胞衰老相关的IPF发生和发展。降低细胞衰老水平或清除衰老细胞可以减轻纤维化程度。在最近的一项临床试验中，Senolytics药物首次用于治疗IPF患者，改善了IPF患者的生理功能障碍，然而其具体机制尚未明确。进一步探究细胞衰老相关机制及其在IPF发生和发展中的作用，将为这种致死性疾病提供新的治疗契机。
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